诱导白血病的基因突变协同重构染色质来调控

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#白血病#

我们人体每天可以新制造出~0亿个血细胞。所有血细胞从源头上可追溯至早期原始的造血干细胞，后者可以分化为不同阶段和各种谱系的祖细胞，负责生成不同类型的功能成熟的血细胞。成年人中大约存在10万个活跃的造血干细胞。这些干细胞以及祖细胞在生理因素（例如衰老）或病理因素（例如病毒感染）影响下可发生基因突变，发生恶性转化成为白血病干细胞，进而产生出大量过度增殖但分化受阻的白血病细胞。急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia，AML）是成年人中最常见和预后差的急性血液恶性肿瘤，主要累及髓系细胞。一些在AML中高频突变的基因，可作为白血病发病的关键诱因，其如何通过调控染色质状态和DNA三维构象来影响基因表达却仍不明确。

年9月23日，由剑桥干细胞研究所，剑桥大学血液系，维康桑格研究所等机构的科学家组成的研究小组近期在NatureGenetics杂志上发表了题为Mutationalsynergyduringleukemiainductionremodelschromatinaccessibility,histonemodificationsandthree-dimensionalDNAtopologytoaltergeneexpression的文章。该项研究利用携带AML突变基因的转基因小鼠模型结合多种研究基因表达调控的组学技术，描述了常见基因突变在诱发白血病的过程中如何协同影响染色质活性和DNA拓扑结构来调控基因表达。通过对多组学数据的整合分析，研究人员识别出了白血病基因调控网络的关键节点和调控元件，并进一步利用基因编辑和沉默技术证实了这些因子对维持白血病细胞的增殖和克隆形成能力的关键作用。

NPM1和FLT3是AML最常见的两个突变基因，其同时突变可见于15%的AML病人。研究人员利用野生型（WT），携带Npm1或Flt3单基因突变（Npm1c和Flt3-ITD），以及双突变（doublemutant，DM）的小鼠作为研究模型。单基因突变的小鼠在出生后一年内造血功能基本正常，之后会逐渐发生造血异常。而双基因突变可以于6至8周内在小鼠体内快速诱发AML。研究者从不同基因型小鼠的骨髓中分选出造血干祖细胞（Hematopoieticstemandprogenitorcell，HSPC），对其进行了基于高通量测序的多组学实验和分析，包括研究基因表达谱的RNA-seq，研究染色质状态的ChIP-seq和染色质可及性的ATAC-seq，以及利用promotercaptureHiC（pCHiC）技术研究DNA拓扑结构和基因表达调控元件之间的相互作用（图1）。

图1.多组学实验研究白血病基因突变对染色质状态和构象的影响

在基因转录水平上，双突变小鼠的HSPC与两种单突变和野生型有着显著差异。Npm1c或Flt3-ITD会诱发数百个基因的表达水平发生改变，而DM则有数千个基因改变，且上调或下调的幅度也显著高于单突变。基因组关联分析进一步显示Npm1c和DM会共同下调一些造血相关因子，而FIt3-ITD和DM会活化肿瘤坏死因子的信号通路以及干扰素诱发的免疫反应。

单突变的HSPC显示广泛的染色质可及性改变，而突变的组合呈现出显著的协同效应。FIt3-ITD单突变的染色质可及性改变的大部分与DM重合，而变化程度弱于DM。转录因子PU.1和GATA分别出现在DM诱发的染色质打开和关闭的区域，提示其可能在这些区域参与转录调控。为识别基因调控元件增强子，研究团队接下来使用ChIP-sep分析了3种组蛋白修饰：H3K4me1，H3K4me3和H3k27ac。对增强子标志H3K4me1进行分析，发现FIt3-ITD和DM有显著的变化，而Npm1c只有极少数的位点改变，说明FIt3-ITD而非Npm1c影响了增强子的染色质状态。增强子活化标志H3K27ac的变化模式与H3K4me1相似。通过与髓系细胞增强子的比较发现，DM诱发的HSPC增强子的获得有70%是白血病特异性改变，30%则呈现髓系分化特征。

利用pCHiC技术可以研究基因组空间构象，包括染色质的A/B区室结构以及增强子和启动子之间相互作用。研究人员发现单突变对染色质区室没有明显的改变，而双突变可显著改变染色质区室，累及数百个基因，其中包括重要的癌基因Setbp1。在突变对启动子与增强子的相互作用的影响上，单突变呈现弱变化，双突变仍显示强协同效应。

研究团队应用类似于单细胞测序的分析方法，将染色质多重标志进行整合分析，揭示出了不同模式的顺式作用元件组合（图2a，b）。对其中两组特征性的元件组合（DM导致的增强子获得或丢失）进一步分析，分别呈现出不同的转录因子结合序列和受累及的特异基因。通过对多组学的整合分析，研究人员识别和构建出和白血病密切相关的基因调控网络和其关键节点，其中包括顺式作用元件：Spi1增强子，Hoxa超级增强子；转录因子：AP-1，Spi1（编码PU.1），Irf8；白血病激活的关键基因：Hoxa9，Hoxa10，Igf1。其中Hoxa超级增强子被首次发现，该区域位于Hoxa基因簇5’端上游约1Mb，存在于Npm1c和DM的HSPC中（图2c）。

图2.多组学数据整合分析揭示不同模式的白血病基因网络的顺势调控元件

最后，研究者在小鼠和人的白血病细胞中验证上述关键基因和调控元件是否对维持白血病细胞功能有重要作用。在携带Npm1c和Flt3-ITD双突变的小鼠白血病细胞中，shRNA介导的涉及AP-1复合物成员c-Fos和c-Jun，Spi1，以及Hoxa9和Hoxa10的基因下调可显著抑制白血病细胞的生长和生成克隆的能力。使用CRISPR-Cas9技术删除Hoxa超级增强子和Spi1增强子，可以显著降低靶基因的表达，并显示出和基因沉默相似的表型。在分别携带NPM1c和FLT3-ITD的人白血病细胞中，下调关键基因SPI1，IRF8和IGF1的表达可显著抑制白血病细胞的增殖和克隆形成能力。

这项研究揭示了白血病常见基因突变可以不同程度地单独或协同影响基因表达谱、染色质活性和DNA三维构象，参与诱导白血病的发生。由多组学整合分析识别出的调控这些改变的关键基因和元件，可成为削弱白血病致病性的靶向目标，为白血病的临床治疗提供新的可能性靶点。

该研究的主要工作在英国剑桥大学BrianHuntly实验室完成，第一作者为贠海洋博士，BrianHuntly教授为通讯作者，由GeorgeS.Vassiliou实验室提供小鼠模型。该研究得到了CancerResearchUK，theEuropeanResearchCouncil，MRC，theKayKendallLeukaemiaFund以及theWell