PacBioIsoSeq揭示急性B淋

近日，高分文章利器的PacBio单分子长读长测序技术，以其独特的强势应用全长转录本测序（Iso-Seq）再次助力急性B淋巴细胞白血病的相关研究。一篇来自于美国孟菲医院计算生物学系，JinghuiZhang研究团队的文章登上了NatureCommunications。在这一篇文章中，作者运用了包括PacBioIso-Seq在内的技术研究了在一种包含IGH-DUX4易位的B-ALL细胞系Nalm6中，IGH易位事件与其等位基因排斥之间的相互作用。

通过Iso-Seq技术，作者不仅确定了IGH-DUX4易位相关的全长转录本，还通过CCS的方式，准确的定位了全长转录本上SNP的类型，进一步研究了IGH等位基因的不平衡表达。

作为目前仅有的能够同时满足长读长和高准确率的测序方法，Iso-Seq能够在读取全长转录本的同时，更进一步的给出准确的SNP信息，从而以Isoformphasing的方式为此类临床研究提供测序方案。

IGH（ImmunoglobulinHeavyChain，免疫球蛋白重链）基因的易位与多种肿瘤疾病相关。其中与急性B淋巴细胞白血病（B-cellacutelymphoblasticleukemia,B-ALL）相关的为IGH-DUX4易位。即DUX4基因序列插入到IGH内部，形成DUX4/IGH融合基因并异常高表达，其存在是B-ALL分类的一个重要新型标志物。而DUX4所处的区域不仅富含GC碱基，还伴随具有抑制功能的D4Z4重复序列，这使得以-bp的NGS短读长测序技术往往难以进行深入的分析和研究。

DUX4作为一个转录因子通常情况下并不表达，仅仅在发生染色质松弛时表达，比如在胚胎的卵裂期（2/4/8细胞胚胎）的早期胚胎中，又或是在具有面肩肱型肌营养不良（FSHD）个体的成肌细胞中，当失去了D4Z4重复序列的抑制后，DUX4开启表达。而此研究中，B-ALL相关亚型疾病发生早期出现的IGH-DUX4易位，导致了DUX4的异常激活。

图1：IGH等位基因及IGH-DUX4易位

在该文章涉及的模型中，作者选择了具有IGH-DUX4易位融合的Nalm6细胞系来进行研究。通常在B细胞中，遵循着一个B细胞，一种抗体的原则，呈现IGH等位基因排斥。也就是说在B细胞的发育过程中，只有表达一个IGH等位基因，另一个则出现了沉默。通过比较Nalm6细胞系DUX4的表达明显高于正常卵裂期，符合IGH-DUX4易位融合表达的情况。然而，通过对比IGH相关的功能性基因Igμ，则发现DUX4的表达则相对低很多。这说明IGH-DUX4的易位融合事件，可能发生于沉默的等位基因。

为了对IGH-DUX4的结构有一个更全面的了解，作者采用PacBioIso-Seq方法，在Sequel1M芯片上对功能性Igu，IGH-DUX4融合基因，以及反义DUX4的全长转录本进行鉴定。而同时这一方法也有助于研究等位基因特异性的转录本表达，作者据此也提出了在B细胞发育过程中IGH-DUX4易位发生于IGH沉默的等位基因的假设。

图2：IGH-DUX4易位区附近的全长转录本。

（a）在IGH-DUX4易位区附近组装的DNA序列。

（b）将Iso-SeqCCSreads的定位结果与组装的DNA序列进行对比。包括所鉴定到的功能性Igμ、两个IGH-DUX4融合转录本，以及含有IGHM外显子的反义DUX4转录本。

基于PacBioIso-Seq的CCS读取方式，通过环形一致性序列得到的高准确度全长转录本，进而可以获得来自全长转录本的SNP信息。作者基于此进一步的研究Nalm6中两个等位基因的DUX4和IGH基因的表达。IGHM基因座是具有三个SNP的二倍体，呈现IGH野生型的A-A-A与IGH-DUX4融合的T-G-G。而通过Iso-Seq分析显示：

功能性Igμ的表达仅来自表现为A-A-A的IGH野生型

反义DUX4的表达完全来自表现为T-G-G的IGH-DUX4融合等位基因。

通过CCS所得到的SNP，准确区分了等位基因的不平衡表达，进而证明IGH-DUX4的表达来自于沉默的IGH等位基因。

图3：PacBio环形一致性测序（CircularConsensusSequencing，CCS）

图4：Nalm6中两个等位基因的DUX4和IGH基因表达图。功能性Igμ和反义DUX4由不同的等位基因表达。其中，IGHM基因座是具有三个SNP的二倍体，呈现IGH野生型的A-A-A与IGH-DUX4融合的T-G-G。

在后续的研究中，作者还发现DUX4的高表达会导致细胞出现凋亡。结合包括Iso-Seq，WGS，Hi-C，ATAC-Seq，RNA-seq在内的多种基因组学分析，作者提出了更进一步的假设：

在早期pro-B细胞发育期间，出现了IGH-DUX4的断裂点。

然而在后期，如果IGH-DUX4易位等位基因被激活，DUX4过表达则会导致细胞凋亡。

因此，只有野生型IGH是具有活力，而IGH-DUX4则出现了沉默。

同时，在相关病人样本中，也同样出现了类似的表达，以及同样检测到了IGH-DUX4的断裂点存在，说明形成于相同的机制。

图5：作者提出的模型假设：在B细胞发育期间IGH-DUX4易位和IGH等位基因排斥之间的相互作用

原文信息：

Tian,Liqing,etal."Long-readsequencingunveilsIGH-DUX4translocationintothesilencedIGHalleleinB-cellacutelymphoblasticleukemia."NatureCommunications10.1():.

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本文转载自基因快讯，PacBioSMRT测序技术目前只能应用于科研。