白凤菜总黄酮对急性髓系白血病Kasum

［通讯作者］林燕燕（１９８０—），女（汉），硕士研究生，副教授，研究方向：生物化学、天然食物功效成分研究．Ｅ?ｍａｉｌ：ｌｉｎｙａｎｙａｎ?ｌｉｕ＠１６３.ｃｏｍ

［摘要］目的：探讨白凤菜（ＧｙｎｕｒａｆｏｒｍｏｓａｎａＫｉｔａｍ．）总黄酮（ＴＦＧ）对急性髓系白血病Ｋａｓｕｍｉ－１细胞的增殖和凋亡的影响。方法：采用噻唑蓝（ＭＴＴ）实验检测Ｋａｓｕｍｉ－１细胞经ＴＦＧ处理２４、４８ｈ后细胞增殖情况，倒置显微镜及荧光显微镜下观察Ｋａｓｕｍｉ－１细胞经ＴＦＧ处理２４ｈ后细胞形态及凋亡的变化，流式细胞术检测细胞凋亡及周期。结果：ＴＦＧ明显抑制Ｋａｓｕｍｉ－１细胞的增殖，且呈浓度依赖性；１２.５μｇ／ｍｌ和２５μｇ／ｍｌＴＦＧ实验组的Ｋａｓｕｍｉ－１细胞凋亡明显增加，且ＴＦＧ使细胞周期阻滞于Ｓ期。结论：ＴＦＧ可抑制Ｋａｓｕｍｉ－１细胞增殖，可能同细胞周期的捕获和细胞凋亡的诱导相关。

［关键词］白凤菜；总黄酮；Ｋａｓｕｍｉ－１细胞；细胞凋亡

急性髓系白血病（ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＭＬ）是一类髓系造血干／祖细胞恶性疾病，以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征。尽管治疗方法和新技术不断优化和发展，绝大多数患者预后仍不理想［１－２］。因此，迫切需要新的药物来辅助治疗、提高疗效。从植物中开发出低毒、高效甚至高度特异性的靶向药物一直是临床热点之一。植物总黄酮（ＴＦＧ）具有抗氧化、抗肿瘤等多种活性，尤其在抗肿瘤的开发中具有潜在的价值。有文献报道其在乳腺癌、肺癌、食管癌等实体瘤细胞体外实验均有诱导凋亡的作用［３－６］，但对血液系统的肿瘤研究鲜见报道。本课题组从白凤菜（ＧｙｎｕｒａｆｏｒｍｏｓａｎａＫｉｔａｍ．）中提取了ＴＦＧ，旨在体外观察ＴＦＧ对ＡＭＬＫａｓｕｍｉ－１细胞的增殖及凋亡的影响。

１材料与方法

１.１主要试剂与仪器Ｋａｓｕｍｉ－１细胞由福建医科大学天然药物药理学重点实验室惠赠；ＲＰＭＩ１６４０培养液、磷酸盐缓冲液和胎牛血清购于美国Ｇｉｂｃｏ公司；噻唑蓝（ＭＴＴ）细胞凋亡试剂盒、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ凋亡试剂盒、线粒体膜电位试剂盒、细胞周期试剂盒购自上海碧云天公司；荧光显微镜、多功能酶标仪购自美国ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司；流式细胞仪购自美国ＢＤ公司；倒置显微镜购自日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司。

１.２方法

１.２.１ＴＦＧ的制备白凤菜由台湾引种，ＴＦＧ的制备参见文献［７］。根据亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠比色法使样液显色，测定吸光度［８］，计算样液中的ＴＦＧ含量为２.７６ｍｇ／ｍｌ。

１.２.２细胞培养将Ｋａｓｕｍｉ－１细胞接种于含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液中，３７℃、５％ＣＯ２、湿度饱和的恒温培养箱中培养，每１～２ｄ传代１次，取对数生长期细胞为实验对象。

１.２.３细胞抑制率检测使用ＭＴＴ法检测细胞体外增殖。以５×１０３个／孔的密度将细胞接种于９６孔板１００μｌ的培养基中，设４个重复孔，利用高压灭菌的蒸馏水稀释ＴＦＧ，使各组ＴＦＧ至终质量浓度分别为０、６.２５、１２.５、２５、５０、１００μｇ／ｍｌ并分别培养２４、４８ｈ。空白对照为无细胞培养基，有Ｋａｓｕｍｉ－１细胞而未添加ＴＦＧ的孔为阴性对照组（１００μｌ）。随后，在每个孔中加入１０μｌＭＴＴ溶液（５ｍｇ／μｌ溶解于ＰＢＳ），将其放回细胞培养箱中继续孵育４ｈ。每孔加入１００μｌＦｏｒｍａｚａｎ溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内继续孵育３ｈ，直至Ｆｏｒｍａｚａｎ全部溶解。随后酶标仪在５７０ｎｍ测定吸光度，重复３次，计算细胞存活率和抑制率。细胞存活率＝（Ａ实验－Ａ空白）／（Ａ对照－Ａ空白）×１００％；抑制率＝１－细胞存活率。

１.２.４细胞形态学观察收集对数生长期细胞，以５×１０５个／孔接种于６孔板，设置各实验组ＴＦＧ终质量浓度为０、６.２５、１２.５和２５μｇ／ｍｌ，于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中孵育２４ｈ，随后在倒置显微镜下进行细胞形态学观察并拍照。

１.２.５线粒体膜电位检测将Ｋａｓｕｍｉ－１细胞用ＴＦＧ终质量浓度为０、６.２５、１２.５和２５μｇ／ｍｌ作用２４ｈ后，１０００ｒ／ｍｉｍ离心５ｍｉｎ，弃上清，收集细胞，用ＰＢＳ轻轻重悬细胞并计数。取１×１０５重悬的细胞，１０００ｒ／ｍｉｍ离心５ｍｉｎ，弃上清，加入１８８μｌＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ结合液轻轻重悬细胞。加入２μｌＭｉｔｏ－ＴｒａｃｋｅｒＲｅｄＣＭＸＲｏｓ染色液、５μｌＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ，轻轻混匀。室温避光孵育２０～３０ｍｉｎ，孵育过程中重悬细胞２～３次，随后置于冰浴２０ｍｉｎ，１０００ｒ／ｍｉｍ离心５ｍｉｎ，收集细胞，用１００μｌＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ结合液轻轻重悬细胞，荧光显微镜下随机选择视野拍照。

１.２.６细胞凋亡检测取处于对数生长期的Ｋａｓｕｍｉ－１细胞，以５×１０４个／ｍｌ接种３ｍｌ／孔于６孔板，培养箱中孵育过夜。各组分别用０、６.２５、１２.５和２５μｇ／ｍｌ的ＴＦＧ作用于细胞２４ｈ后各自收集培养体系内全部细胞，１２００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，加入１９５μｌＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ结合液轻轻重悬细胞，依次加入５μｌＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ、１０μｌ碘化丙啶（ＰＩ）染色液，轻轻混匀。室温（２０～２５℃）避光孵育１０～２０ｍｉｎ，随后置于冰浴中，随后充分混匀入流式细胞仪检测。

１.２.７细胞周期检测取处于对数生长期的Ｋａｓｕｍｉ－１细胞，制备细胞悬液５×１０４个／ｍｌ，接种３ｍｌ／孔于６孔板，各组分别用０、６.２５、１２.５和２５μｇ／ｍｌ的ＴＦＧ作用于细胞，培养箱中孵育２４ｈ。随后收集各培养体系中全部细胞，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，加入１ｍｌ预冷ＰＢＳ重悬细胞，离心收集细胞，加入１ｍｌ冰浴预冷７０％乙醇，吹打混匀，４℃固定２ｈ，随后１０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃上清，预冷ＰＢＳ洗涤２次，每管细胞样品中加入０.５ｍｌＰＩ染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，３７℃避光温浴３０ｍｉｎ。充分混匀后，进样于流式细胞仪检测计算Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期所占百分比。

１.３统计学方法采用ＳＰＳＳ２１.０软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析、ｔ检验，Ｐ＜０.０５为差异有统计学意义。

２结果

２.１ＴＦＧ对Ｋａｓｕｍｉ－１细胞体外增殖抑制的影响与对照组比较，ＴＦＧ作用２４ｈ后１２.５μｇ／ｍｌ及以上浓度实验组，ＴＦＧ作用４８ｈ后６.２５μｇ／ｍｌ及以上浓度实验组，Ｋａｓｕｍｉ－１细胞抑制率呈现出显著差异（Ｐ＜０.０５），呈浓度依赖效应。分别以２４和４８ｈ的抑制率对ＴＦＧ浓度绘制生长抑制曲线，可得ＴＦＧ对Ｋａｓｕｍｉ－１作用２４ｈ和４８ｈ的ＩＣ５０分别为１８.８０μｇ／ｍｌ和７.９μｇ／ｍｌ。见图１。

２.２ＴＦＧ对Ｋａｓｕｍｉ－１细胞形态的影响Ｋａｓｕｍｉ－１细胞易成团生长；随着ＴＦＧ质量浓度的升高，Ｋａｓｕｍｉ－１细胞团数量减少，形态皱缩，边缘粗糙，胞体缩小，胞体折光度减小，内含物减少。见图２

２.３细胞荧光凋亡检测对照组中细胞核排列相对紧密，核染色质分布均匀，发出红色荧光，未见绿色凋亡荧光细胞；６.５μｇ／ｍｌＴＦＧ实验组中细胞数量、排列及荧光与对照组比较无明显差异，可见散在绿色凋亡荧光细胞；与对照组比较，１２.５μｇ／ｍｌＴＦＧ实验组中细胞数量减少，较多细胞出现明亮绿色荧光细胞，表明部分细胞的细胞膜受损；２５μｇ／ｍｌＴＦＧ实验组中细胞数量下降明显，细胞胞体不均一，部分发生染色质凝集和细胞膜破损，出现较多明亮绿色荧光细胞。见图３。

２.４ＴＦＧ对Ｋａｓｕｍｉ－１细胞凋亡的检测Ｋａｓｕｍｉ－１细胞经ＴＦＧ处理２４ｈ后，０、６.２５、１２.５和２５μｇ／ｍｌＴＦＧ组细胞凋亡率分别为（２.２±０.２）％、（３８.７±１.９）％、（５０.６±３.７）％和（９３.０±８.２）％；与对照组比较，随着ＴＦＧ质量浓度的升高，细胞凋亡比例逐渐增加（Ｐ＜０.０５）。见图４。

２.５ＴＦＧ对Ｋａｓｕｍｉ－１细胞周期分布的影响ＴＦＧ处理２４ｈ后，６.２５、１２.５μｇ／ｍｌＴＦＧ实验组与对照组Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期细胞比例比较差异无统计学意义；但２５μｇ／ｍｌＴＦＧ实验组的Ｓ期细胞比例高于对照组，Ｇ２／Ｍ期细胞比例低于对照组（Ｐ＜０.０５）。见图５。

３讨论

自然来源的营养素能有效消除癌症细胞，探索天然、高效和低毒的药物进行长期的辅助抗癌具有重要意义。在本课题组前期研究中已经证实ＴＦＧ对肝癌ＨｅｐＧ２细胞亦有明显的诱导凋亡作用［７］，ＴＦＧ作用２４ｈ及４８ｈ的ＩＣ５０分别为１９０.８０μｇ／ｍｌ和１２５.９６μｇ／ｍｌ。而本研究结果显示ＴＦＧ作用Ｋａｓｕｍｉ－１细胞２４ｈ及４８ｈ的ＩＣ５０分别为１８.８０μｇ／ｍｌ和７.９μｇ／ｍｌ。在线粒体膜电位荧光凋亡检测中显示，随着ＴＦＧ的浓度升高，磷酯酰丝氨酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ，ＰＳ）从质膜的内部外翻到细胞表面即细胞膜外侧，从而使ＰＳ暴露于细胞外部，与带有绿色荧光的ＦＩＴＣ标记的ＡｎｎｅｘｉｎＶ染色，结果显示绿色荧光细胞随药物作用的浓度增加细胞凋亡明显。流式凋亡检测结果与线粒体膜电位检测结果一致。细胞周期检测表明ＴＦＧ可影响Ｋａｓｕｍｉ－１细胞周期分布,使细胞周期阻滞于Ｓ期。

综上所述，一定质量浓度的ＴＦＧ可抑制Ｋａｓｕ?ｍｉ－１细胞活性并诱导其凋亡，待进一步研究作用机制及动物实验后，为研究和开发ＴＦＧ作为抗ＡＭＬ的天然药物提供理论基础。参考文献略