雷公藤内酯酮靶向HedgehogFLT3

浙大二院血液内科团队新近研究发现：天然小分子抑制剂雷公藤内酯酮（TN）可在体内外有效抑制FLT3-ITD驱动的AML细胞增殖。机制上，TN通过靶向Hedgehog/FLT3信号轴，诱导FLT3-ITD细胞凋亡。该研究成果近期将发表于BiomedicinePharmacotherapy，第一作者为浙大二院血液科博士研究生徐莹，通讯作者为浙大二院血液科徐荣臻教授。

急性髓系白血病（AML）是一类高度影响人群健康的造血干细胞恶性克隆增殖性血液系统肿瘤，生存预后较差，五年生存率不足40%。FMS样酪氨酸激酶-3（FLT3）基因内部串联重复（FLT3-ITD）突变在正常核型的AML中发生率高达30%。越来越多的研究证据表明,FLT3-ITDAML患者表现出更差的临床预后，该类患者常伴随更高的白血病负荷和疾病复发/致死率，且常常对目前经典化疗药物耐药。

近年来，针对FLT3-ITDAML患者，已开发出多种FLT3抑制剂，包括索拉非尼（sorafenib）、米哚妥林（midostaurin）、奎扎替尼（quizartinib）和吉列替尼（gilteritinib）等，尽管该类抑制剂在多种临床试验中取得了一定程度的抗白血病效应，然而由于原发或继发耐药、脱靶效应以及价格昂贵等诸多问题，使得这些抑制剂并不能很好地在临床上进行大规模的推广应用。因此，探索新的肿瘤靶点或其他靶向FLT3-ITD小分子抑制剂成为治疗难治复发AML的重要研究策略。为此，我们探究了雷公藤内酯酮在FLT3-ITDAML的作用和机制。

研究模式简图

雷公藤内酯酮（Triptonide，TN）是从中草药雷公藤(T.willordiiHook)中提取单体小分子，其化学名称为二萜内酯三环氧化物，分子量大小为.39。

雷公藤及雷公藤内酯酮分子结构

目前尚不明确TN对FLT3-ITDAML的抗肿瘤活性。我们应用经典MTT法研究了其对FLT3-ITDAML（MOLM-13和MV4-11），野生型FLT3AML（KG-1，KG-1a和Kasumi-1）和正常细胞（L02（肝脏）和HEK（肾脏））的抗增殖活性。结果表明TN以nM水平以剂量依赖性方式抑制FLT3-ITDAML细胞增殖。TN对FLT3-ITD阳性MOLM-13细胞的IC50值分别比野生型FLT3AML低2.5-3.5倍，比正常细胞低11.6-30倍。这些结果表明，TN能够选择性抑制FLT3-ITDAML细胞增殖。

TN选择性抑制FLT3-ITDAML细胞增殖

为了进一步揭示TN抑制FLT3-ITDAML细胞增殖的潜在机制，应用流式细胞仪评估了TN对MOLM-13细胞细胞周期及凋亡的影响，发现TN能够诱导MOLM13细胞G0/G1期阻滞以及细胞凋亡增加。

TN诱导FLT3-ITD细胞周期G0/G1期阻滞及凋亡增加

以往的研究表明Hh信号通路转录因子GLI家族在FLT3-ITDAML中起关键作用，因此我们对GLI家族在FLT3-ITDAML中的表达水平进行了评估。GEO数据库分析表明，与野生型FLT3AML样本相比，GLI2表达在FLT3-ITD中高表达，但未发现GLI1和GLI3表达差异。

GLI2高表达于FLT3-ITDAML细胞

随后我们检测了TN对FLT3-ITD细胞中GLI2和FLT3的表达影响，发现TN以剂量和时间依赖性方式降低GLI2和总/磷酸化FLT3蛋白的表达；且TN并不改变MOLM-13细胞中FLT3mRNA水平，表明FLT3蛋白的下调与转录后调控有关。同时发现TN对调控细胞周期进程的两个关键分子CDK4和CDK6没有明显影响，这表明TN对GLI2和FLT3的降低并不是非特异性毒性的结果。GLI2是c-Myc和p53蛋白的重要调节分子。因此，进一步分析发现，TN能够诱导c-Myc蛋白减少和p53蛋白增加。这些结果表明TN可以选择性地靶向FLT3-ITDAML细胞中的Hh/FLT3信号轴。

在小鼠原位FLT3-ITD阳性AML模型中，验证了TN杀伤FLT3-ITDAML细胞的体外结果，发现TN以剂量依赖性方式在NSG小鼠中发挥抗肿瘤活性，且TN在治疗剂量下对小鼠表现出良好耐受性。

TN在体内抑制FLT-ITDAML细胞增殖

浙大二院血液科研究团队首次确定了雷公藤内酯酮是抑制FLT3-ITDAML细胞的重要小分子化合物，并证明其通过靶向Hh/FLT3轴发挥作用，为临床上FLT3-ITD突变的难治复发AML提供了新的治疗策略。

作者：吴照星审校：徐荣臻