B细胞急性淋巴细胞白血病CD19CAR

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近日，GPB在最近一期以封面文章发表了华中科技大学郭安源课题组题为"TranscriptomeandRegulatoryNetworkAnalysesofCD19-CAR-TImmunotherapyforB-ALL"的研究论文。我们的“要文译荐”栏目很高兴邀请到郭教授亲自为大家解读B细胞急性淋巴细胞白血病CD19-CAR-T免疫治疗的转录图谱和网络分析。

背景

B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）是由B细胞发育异常导致的B淋巴细胞成熟异常停滞、细胞凋亡的逃避和不受控制的细胞增殖。在化疗、放疗成功受限的情况下，具有识别B细胞恶性肿瘤特异性抗原CD19的重编程嵌合抗原受体（CAR）的T细胞（CD19-CAR-T）被认为是B-ALL免疫疗法中非常有希望的方法。CD19-CAR-T可以识别和消除肿瘤细胞，并且已经证实在复发/难治性B-ALL患者中有显著的诱导缓解功效。

大多数关于CAR-T免疫疗法的研究都集中在临床疗效和新抗原的发展上，缺少对CAR-T治疗前后患者基因表达谱及其调控网络的研究。转录组分析已被广泛用于研究癌症复发和治疗的分子机制。microRNAs（miRNAs）和转录因子（TFs）形成的调控模块在免疫细胞和肿瘤的发生发展中发挥关键作用，从而影响免疫治疗。此外，不同条件下（例如，缓解或非缓解）的患者的转录组图谱和调控网络研究可以为CAR-T疗法的潜在分子机制提供相关线索。

这一期GPB期刊封面文章报道了华中科技大学郭安源教授团队通过高通量的转录组测序，首次描绘了4名成人的难治性B-ALL患者接受CD19-CAR-T治疗前后骨髓细胞的转录组图谱。同时通过临床诊断以及测序分析对其进行疗效评估。基于对差异表达基因、长非编码RNA（lncRNA）和miRNA的分析，提出了可能参与B-ALL的CD19-CAR-T治疗过程的调控网络示意模型。

结果与总结

本研究以4例B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者接受特异性靶向CD19分子的CAR-T治疗前后骨髓（BM）细胞以及外周血（PB）样本为对象进行后续分析。临床信息诊断显示CD19-CAR-T治疗后，患者白血病细胞的数量显著减少，并且实现了3名患者的骨髓缓解（微小残留病阴性）（表1）。

研究发现未缓解患者（命名为NR-B）在输注CAR-T后，IL-6/8/10/2R的浓度显着增加，表明存在严重的细胞因子反应风暴（CRS）。其中2名患者在CAR-T治疗后，PB和BM中的CAR-T细胞数量均显着增加。巧合的是，PB和BM中CAR-T细胞比例最高的R-C患者保持了长时间的持续缓解（已达13个月），而具有最低CAR-T细胞含量的患者NR-B未缓解（图1）。

图1CD19-CART临床试验的时间表以及CRS相关因子和CAR-T细胞的水平

接下来，研究者探究了CD19-CAR-T治疗前后肿瘤病灶的转录谱。发现CAR-T疗法导致肿瘤微环境和免疫细胞群的改变。研究发现有缓解患者的微环境相关基因表达水平有显著增加，尤其是CAR-T输注后趋化因子和免疫刺激因子的表达被激活，而这些因子似乎对NR患者中的CAR-T治疗没有反应。进一步地，CD19-CAR-T治疗B-ALL的疗效与CAR和免疫细胞亚群（例如骨髓中的CD8+T细胞和自然杀伤（NK）细胞）的丰度正相关。NR患者中残留白血病前B细胞的数量较高，几乎检测不到T细胞，且参与CD8+T细胞活性的基因的表达水平较低。同时，CAR和CD19的表达水平在D14样本中显示相反的趋势，这与临床结果一致。此外，作者发现89个膜蛋白基因的表达水平与CAR和/或CD19水平高度相关，其中16个据报道与白血病有关（图2）。

图2CAR-T输注前后BM样本中CAR、CD19和与免疫相关的基因的表达

另外，比较每位患者CD19-CAR-T输注之前和之后的基因表达水平时，作者分别检测到-个差异表达的基因（DEG）。其中在3个缓解样本中一致性上调或下调的基因可能在CAR-T治疗中有重要作用。之后对所有DEG进行了KEGG通路和GO功能富集分析发现CD19-CAR-T疗法影响了大量与细胞周期和免疫应答通路相关基因的表达，包括参与NK细胞介导的细胞毒性和NOD样受体信号传导等通路基因（图3）。

图3CAR-T输注后BM样本中DEGs的表达谱和功能富集分析

除了功能富集分析外，作者应用加权基因关联网络分析（weightedgenecorrelationnetworkanalysis，WGCNA)来鉴定功能模块。一共检测到18个功能模块，其中9个模块与细胞凋亡，细胞周期和免疫相关途径高度相关（R0.9，P1E-6）。比如，含有最多数量lncRNAs的turquoise模块基因显著富集在NK细胞介导的细胞毒性，吞噬体和NOD样受体信号等免疫相关通路上，同时这些基因在CAR-T治疗后上调。通过与基因的共表达来探究lncRNAs的功能，在我们的模块中与组蛋白和TF基因高度相关的lncRNA可能参与免疫应答/破骨细胞分化/FOXO信号传导等通路（图4）。

图4含有最多数量lncRNAs的TF-gene-lncRNA共表达调控网络参与免疫相关通路

接着，作者发现16-个在CD19-CAR-T治疗后表达量显著改变的差异表达的miRNAs。通过miRNA-TF-基因的共调控网络分析，发现作为促癌基因或肿瘤抑制因子的miRNA（例如，miR-a-3p和miR-）可以通过调控参与不同免疫通路的核心转录因子基因（TFs，例如JUN和FOS）以及核心组蛋白基因（例如，HIST1H4A和HIST2H4A）的表达以参与CD19-CAR-T治疗的调控。此外，许多参与免疫过程的长非编码RNA与TF或组蛋白基因（例如，FOS和HIST1H4B）高度共表达。结果揭示了CAR-T免疫治疗中潜在的调控模块（图5）。

图5miRNA-TF-基因共调控网络参与CAR-T治疗

本研究报道了4例B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者接受特异性靶向CD19分子的CAR-T治疗前后骨髓细胞的转录组图谱。结果显示了CAR-T细胞的体内扩增的影响以及CD19-CAR-T疗法对B-ALL的免疫细胞群的改变。这些有助于表征临床重要特征并为不同病症的患者开发治疗方法。此外，组蛋白基因与其共表达的lncRNA和TF以及miRNA-TF-基因调控网络等，可能在CD19-CAR-T治疗中发挥重要作用。这些发现表明了这些因子或模块对CD19-CAR-T治疗对B-ALL的影响，并可能为进一步了解CAR-T免疫治疗疗效涉及的基因表达和调控机制提供重要线索。

文章编译来源：QiongZhang,HuiHu,Si-YiChen,Chun-JieLiu,Fei-FeiHu,Jianming,YaohuiWu,An-YuanGuo.TranscriptomeandRegulatoryNetworkAnalysesofCD19-CAR-TImmunotherapyforB-ALL.GenomicsProteomicsBioinformatics,17(2):-.英文全文详见：