靶向CD13和TIM3的双特异性CAR

XinHe,1ZijieFeng,1JianMa,1SunbinLing,1,2YanCao,1BuddhaGurung,1YuanWu,1BrysonW.Katona,1KienanP.O’Dwyer,1DonL.Siegel,3,4CarlH.June,3,4XianxinHua1

1DepartmentofCancerBiology,AbramsonFamilyCancerResearchInstitute,PerelmanSchoolofMedicine,UniversityofPennsylvania,Philadelphia,PA;2DivisionofHepatobiliaryandPancreaticSurgery,DepartmentofSurgery,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,TheFirstAffiliatedHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou,China;3CenterforCellularImmunotherapies;4DepartmentofPathologyandLaboratoryMedicine,PerelmanSchoolofMedicine,UniversityofPennsylvania,Philadelphia,PA

执行主编：吴德沛医院

翻译：何云地王筱淇陆军军医大学

审校：张曦陆军军医大学

点评：张曦陆军军医大学

全文

关键点：

建立STAR系统以产生与CART细胞相容的纳米体和相应的肿瘤相关抗原。

临床前模型中STAR分离的CD13纳米体和抗TIM3重定向的双特异性和分裂CAR-T细胞治疗AML。

摘要

嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor,CAR）T细胞通过靶向CD19从根本上改善了对B细胞来源恶性肿瘤的治疗。这一成功尚未扩展到急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia,AML）的治疗。我们开发了一种序列肿瘤选择性抗体与抗原检索（SequentiallyTumor-SelectedAntibodyandAntigenRetrival,STAR）系统，以快速分离优先结合AML细胞并且增强CART细胞抗AML效应的多种纳米体（nanobodies,Nbs）。STAR分离的Nb能特异性结合在AML细胞上高表达的CD13，CD13CART细胞在体内外均能有效清除AML。对CD13和TIM3具有双特异性的CAR-T细胞在AML白血病干细胞中表达上调，可根除患者来源的AML，且对人骨髓干细胞和小鼠模型的外周髓系细胞的毒性大大减弱，为CART细胞有效治疗AML提供了有前景的治疗方法。(Blood.;(10):-)

前言

肿瘤免疫治疗取得了令人瞩目的进展，改变了肿瘤治疗的进程[1-6]。利用表达嵌合抗原受体（chiericantigenreceptor,CAR）的T细胞，过继性T细胞抗癌治疗可以通过靶向CD19来根治复发性/难治性B细胞淋巴瘤或B淋巴细胞白血病[2,7]。CAR的结构有一个胞外域，它通常由来源于单克隆抗体（monoclonalantibody,mAb）的单链可变区片段（single-chainvariablefragment,scFv）组成，并通过跨膜结构域锚定在细胞上，其后连接4-1BB和/或CD28胞内共刺激结构域，以及CD3z信号结构域[8,9]。尽管CD19CART细胞疗法取得了显著成就，这一成功尚未扩展到其他类型肿瘤，如5年生存率很低的急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia,AML）。除抑制性微环境等其他因素外[10,11]，缺乏可选择的mAb是扩大CART细胞应用的一大障碍。

肿瘤特异性突变或过表达的细胞表面蛋白的胞外结构域是CART细胞治疗技术最理想的靶点。然而，可获得的适宜于开发CART细胞治疗的、针对许多潜在靶点的mAb非常有限。此外，许多mAb不能赋予T细胞细胞毒性，这要求T细胞和靶细胞之间适当结合，以诱导产生免疫突触并促进癌细胞死亡[12]。因此需要生产能解决这些问题的多种抗体。由于抗体的四聚体重链和轻链较大，再加上生产最佳scFv所带来的挑战，传统抗体无法与某些特定的抗原表面结合[13]。包括美洲骆驼在内的骆驼类动物家族，可以利用小分子量的（15kDa）的单变结构域（纳米体[nanobody,Nb]），产生仅有重链的抗体以结合各种抗原表位[14]。此外，Nb的单个结构域能更有效地生成功能性CART细胞[15]。通过靶向从未被鉴定过的细胞表面抗原或靶点，快速鉴定CART细胞相容性Nb及其相关抗原，可迅速扩大供选择的CART细胞，以开展有效的肿瘤免疫治疗。

对化疗耐药的AML需要一种新的治疗方法，因为它侵袭性很高且预后很差[16,17]。有人曾经试图用靶向细胞表面凝集素CD33和白细胞介素-3受体亚单位CD的CAR-T细胞来抑制AML，但它们对造血干细胞（hematopoieticstemcell,HSC）和其他正常组织的不良反应阻碍了它们的应用[18,19]。因此，我们开发了一种序列肿瘤选择抗体与抗原检索（SequentiallyTumor-SelectedAntibodyandAntigenRetrieval,STAR）系统来分离优先结合AML细胞的多种Nb。在临床前模型中，STAR分离的抗CD13抗体以及抗TIM3抗体，在AML白血病干细胞（leukemiastemcell,LSC）中表达上调，共同指导CAR-T细胞根除患者来源的异种移植物（patient-derivedexnograft,PDX）中的AML，同时大大降低了对人HSC的毒性。

方法

用经THP-1细胞免疫的美洲驼来建立Nb噬菌体文库

一只美洲驼用2×个THP-1细胞（Caprologics，哈德威克，马塞诸塞州）免疫，每月免疫一次，共3个月。如前所述，我们还应用了外周血单个核细胞分离、RNA提取和互补DNA（