dTRIM24PROTAC技术对急性白血

1.研究背景

转录调节因子TRIM24(originallytranscriptionalintermediaryfactor1α)是TRIM/RBCC家族蛋白中的一种多结构域蛋白。有研究表明，TRIM24的异常表达与多种癌症密切相关，例如急性白血病，胸腺癌和前列腺癌等。虽然IACS-等TRIM24抑制剂已经问世，但是没有对癌症细胞有明显的抑制作用。因此，研究者们把研究重点转移到PROTAC技术上。在本文中，作者通过PROTAC技术将TRIM24抑制剂进行改造成，从而得到了dTRIM24。并对dTRIM24对急性白血病的作用机制进行研究

2.实验内容

2.1PROTAC的设计与活性检测

作者首先对TRIM24的蛋白晶体结构进行研究（图1），发现了二甲基苯并咪唑酮结构上上可能的结合位点，从而设计合成了以IACS-抑制剂衍生物IACS-7e为基础的dTRIM24和其对映异构体eTRIM24（图2）。通过其对VHL降解决定子的分布进行分析（图3），确定了其有不错的细胞透过性，并且用dTRIM24处理FT细胞得到了在5μm下处理24小时TRIM24降解效果最好（图4）。

接着为了确定TRIM24蛋白的降解确实是依靠PROTAC的双头结构发挥功效，作者通过dTRIM24分别与TRIM24抑制剂和蛋白酶抑制剂共同作用，证实了确实是PROTAC分子把TRIM24和VHL连接一起才能发挥降解作用（图5）。在不表达VHL的细胞中（clone10），dTRIM24无法发挥降解活性，这一现象也证实了确实是VHL发挥着作用（图6）。这些实验说明化合物dTRIM24确实对TRIM24有降解作用，且其机理就是依靠VHL。

图1

图2

图3

图4

图5

图6

2.2对癌症的作用的研究

接下来作者研究了TRIM24在人类癌症细胞中的作用，通过对ProjectAchilles数据库进行筛选（图7），发现急性白血病细胞对TRIM24非常敏感，因此作者研究了TRIM24对急性白血病的影响，由于TRIM24是多功能蛋白，所以本文接着研究了是哪个结构域对MOLM-13细胞抑制起着作用。通过CRISPR–Cas9screens实验，发现人急性白血病细胞MOLM-13对TRIM24的敲除最敏感。RING结构域被敲除，下游信号被抑制，而PHDfinger或是溴结构域的突变不会出现这种现象。说明在癌细胞繁殖中TRIM24的RINGdomain发挥着作用。这也意味着PHD-BROMO对与TRIM24急性白血病中发挥作用在无关轻重，重要的是RING结构域。但是目前RING结构域没有有效的抑制剂，抑制剂IACS-是针对溴结构域结构域设计的，所以作者研究了调节针对溴结构域的dTRIM24能否抑制MOLM-13细胞的繁殖。试验结果表明dTRIM24确实对TRIM24在MOLM-13细胞有抑制作用（图9）。而dTRIM24的选择性也通过定量蛋白质组学确定（图10），通过实验结果我们可以发现dTRIM24选择性的降解了TRIM24，而IACS-7e组中TRIM24与BRPF1基本没有区别。最后作者对比了几种抑制剂对MOLM-13细胞的凋亡作用，发现确实是dTRIM24的抑制效果最好（图11）。

图7

图8

图9

图10

图11

接着作者为了研究dTRIM24对MOLM-13细胞的抑制的作用机制，首先通过染色质免疫共沉淀法确定dTRIM24对染色质的作用（图12）。不出所料，dTRIM24比IACS-在全基因组中对TRIM24抑制效果好。接下来为弄清楚TRIM24在转录中发挥的作用，作者设计了全基因组下的转录反馈实验。结果表明dTRIM24组的对癌症抑制因子BCOR,ERV3,MZF1,和ID3都比IACS-少的多（图13），这些癌症抑制因子在白血病中都过度表达。这种抑制可能就是dTRIM24能抑制白血病的原因。

图12

图13

3.总结

本文设计了TRIM24小分子降解剂dTRIM24,它能够有效的降解TRIM24蛋白，并且通过多组实验证明它确实是通过PROTAC技术和VHL实现降解功能。而且作者研究了dTRIM24在急性白血病的抑制机制，证明了尽管抑制剂针对的结构域与发挥细胞抑制的结构域不同，PROTAC技术仍然能够降解全部TRIM24,从而抑制整个癌细胞的繁殖。这说明PROTAC技术在治疗疾病方面确实有他的独到之处。并且，作者用dTRIM24作为探针，快速的去除TRIM24，从而研究TRIM24在一些疾病中的作用机制。这个我们带来了灵感，可以使用选择性和活性都很优秀的PROTAC作为探针来研究某些蛋白在疾病中的作用。在将来的工作中，可以对dTRIM24进行进一步优化，提高它的活性和膜透过性，从而得到能够治疗急性白血病的新型药物。

本文于年3月5日在线发表于Nature旗下期刊naturechemicalbiology。

第一作者为LaraN.Gechijian,,通讯作者为NathanaelS.Gray和JamesE.Bradner教授哈弗医学院为通讯单位。