急性骨髓性白血病研究新突破化疗抗性烦恼

研究背景

急性骨髓性白血病(AcuteMyeloidLeukemia，简称AML)是血癌中令人闻风色变的一种。与其他几种血癌相比，AML的病情往往来的又快又急，在不加干预的情况下，患者病情可能在半年时间内急剧失控，即便在接受标准化疗的情况下，只有35-40%的病人会痊愈。而且跟着年龄增长，化疗的效果亦大打折扣，在60岁以上的病人中，化疗治愈率迅速下降至5-15%。除了病情发展迅速，治愈率低之外，AML病人还往往面临着化疗抗性和复发的威胁。虽然部分幸运的病人可以通过接受骨髓移植来治疗AML，目前AML依然是血癌中最凶险的一种，

AML的出现是由于骨髓性白细胞出现基因突变而导致异常增殖，具体的诱因既有遗传的因素，亦有外界因素如吸烟，致癌物质暴露等。近年来，通过NGS等新型分子分析手段，医学界成功描绘了AML的全基因组景观图，筛选出高风险的基因突变靶标如TP53等以帮助新型疗法的开发。一方面，AML是一种非常多样化的疾病，目前已知有多种基因突变与AML有关，另一方面，AML在骨髓中的起源亦注定了它与肿瘤免疫微环境有着千丝万缕的关系。与实体瘤研究不一样，目前用于AML的免疫疗法还非常有限。尽管随着免疫疗法在实体瘤治疗战场上的节节胜利，AML亦有可能受惠于免疫疗法，目前关于AML在骨髓中的微环境以及病人对免疫疗法的反应的了解依然非常有限。

近日，来自英国诺丁汉大学的研究团队成功对AML的骨髓肿瘤免疫微环境进行了深度解读，不仅在成年和儿童病患组别中发现了免疫细胞富集与免疫细胞贫乏的组别，并通过基因表达差异及蛋白标记，成功关联了免疫特征与化疗抗性及生存期的影响，为深受化疗抗性困扰的AML病人的临床治疗指出了个体化免疫疗法的可能性。

研究方法

在这项研究中，研究团队一共收集了例AML病患的骨髓取样，其中包括新近诊断的例新病患。研究团队对样本进行了空间生物学原位蛋白测定等多项分析，并对不同组别的病人进行了追踪。最后研究团队对于接受了Flotetuzumab双特异抗体免疫疗法的病人进行了分析。

研究结果

在这项研究中，研究人员首先对FFPE的骨髓样本进行RNA提取并在NanoString的nCounter平台上进行了个基因的表达水平测定。通过无监督聚类分析，发现了根据信号通路及免疫基因表达的差别，AML的样本分为三大类：IFN-gamma主导，后天性免疫主导以及髓细胞主导。当研究人员进一步把这三个类别的免疫细胞基因进行计算时，发现根据IFN-gamma及相关基因的表达量高低，AML样本出现了免疫细胞富集以及免疫细胞贫乏两大类型，但这两个类型的AML常见蛋白表达量是相类似的。假如以CD34,CD等AML常见蛋白作为单一诊断标准的话，将无法对这两个类型的免疫微环境进行深度解析。

图片来源：ScienceTranslationalMedicine

相比免疫细胞贫乏的AML类型，免疫细胞富集的病例普遍更为年长并且病情更轻。为了更好地对免疫细胞富集和免疫细胞贫乏的AML类型进行分析，研究人员选取了10个刚诊断为AML的病人的新鲜冷冻骨髓穿刺样本，在每个样本上对CD3(T细胞)和CD（AML相关抗原）进行染色。然后研究人员根据CD3和CD的荧光信号，对不同的感兴趣区域（RegionofInterest,ROI）进行了选取。下图是ROI选取的示例，可以看到在同一骨髓穿刺样本上，研究人员可以根据不同荧光标记物如CD3,CD的表达量，并结合组织形态学对样本上的某一特定区域进行选取。

图片来源：ScienceTranslationalMedicine

比如下图中，ROI16被定义为T细胞热点，而ROI17被定义为T细胞缺乏。在每个样本上各选取了24个ROI后，研究人员用GeoMxDSP对每个ROI内的31个肿瘤免疫学相关蛋白进行了测定。团队发现，T细胞富集区域高度表达与B细胞,抗原呈现相关等蛋白。而T细胞缺乏区域则主要表达与T细胞耗竭以及PD-1等蛋白。

图片来源：ScienceTranslationalMedicine

通过对每个ROI里面31个不同蛋白的测定，研究人员共得到了10x24x31共个蛋白表达数据点。当把这个数据点进行无监督聚类分析后，研究人员总结出4个蛋白印记（ProteinSignature）。下图从左到右为蛋白印记组别1-4.

图片来源：ScienceTranslationalMedicine

在把这四个蛋白印记与癌症基因图谱计划（TCGA）的基因突变相关联之后，数据显示蛋白印记组别3（AKT/GZMB/STAT3/Bcl-2/pten/FoxP3/PD-L1）在TCGA约26%的AML案例中出现了基因上调以及基因突变等异常，并且与TP53基因突变高度相关。

图片来源：ScienceTranslationalMedicine

那么免疫基因表达的不同又会对病人的长期生存出现怎样的影响呢？在欧洲白血病网（EuropeanLeukemiaNet）的细胞遗传学风险分类下，AML病人的风险组别可分为高中低三类。在低风险AML病人中，免疫细胞富集与生存期延长以及低复发成正相关。而在高风险AML病人中，免疫细胞富集却与较差的预后相关。在中度风险的AML病人中，免疫细胞富集与预后及生存期无关。这个数据说明了AML复杂的病情及肿瘤微环境对于精准化医疗的需求。

图片来源：ScienceTranslationalMedicine

那么为何免疫细胞富集反而会对一些高风险病人的预后产生不利的影响呢？在肿瘤微环境中，IFN-gamma的表达虽然有利于创造发炎并促进T细胞杀死癌细胞，但另一方面，IFN-gamm的过度表达亦会促成免疫抑制和组织修复机制。当研究人员把IFN-gamm的表达量与病人产生化疗抗性的时间长度相关联时，发现在INF-gamm表达量高的病人中病人出现化疗抗性的几率几乎加倍（65.4%versus34.6%;P=0.），说明IFN-gamma的高表达在这些病人中反而会对白血病细胞产生保护作用，从而提高了对化疗产生抗性的可能。

那么问题来了，对于高风险的AML病人来说，假如IFN的高度表达非但不能带来保护性作用，反而会促进化疗抗性的出现，那么临床上是否就对这种病例束手无策了？在实体瘤中，当病例带有高度发炎的肿瘤微环境时，免疫疗法的疗效往往更为出色。那么在AML病人中，免疫疗法是否也能发挥同样的作用呢？目前应用于AML的免疫疗法还有效，其中由Macrogenics开发的flotetuzumab是专门针对AML抗原CD和CD3T细胞的双特异抗体。该抗体的特别之处在于能够通过在同一空间里同时识别CD3和CD,因此更好地结合T细胞来杀死表达CD的白血病细胞。团队从30例接受flotetuzuma疗法的AML病人中采集了治疗前后的骨髓样本，首先通过NanoString的PanCancerIO对个肿瘤免疫相关的基因进行分析。在flotetuzuma疗法起作用的病人中，多过90%出现了免疫细胞富集的情况，同时这些病人的样本中肿瘤发炎指数亦明显升高（关于肿瘤发炎指数，TumorInflammationScore,TIS，可以阅读过往文章：新一代肿瘤免疫标志物-肿瘤发炎指数（TumorInflammationSignature)。不仅如此，在接受了flotetuzuma疗法的病人中，免疫细胞富集的组别的复发率亦大大低于免疫细胞贫乏的组别，说明flotetuzuma双特异抗体疗法在创造了一个高度发炎的肿瘤微环境后，明显改善了病人的生存期和降低了复发率。

图片来源：ScienceTranslationalMedicine

为了证实flotetuzumab确实通过调节免疫微环境来达到治疗效果，研究人员选取了11名对疗法完全有效（CompleteResponse,CR）的病人或无效的病人。在通过GeoMxDSP对这些病人的骨髓样本中的T细胞富集区域进行分析后（下图）,发现在CD+周围富集的CD3T细胞都处于高度激活状态中，说明flotetuzumab确实能在微环境中创造有利的肿瘤杀伤效果。

图片来源：ScienceTranslationalMedicine

研究结论

通过基因表达和空间蛋白表达等多重手段，该项由英国诺丁汉大学在例AML病人骨髓穿刺样本中开展的研究不仅第一次展示了白血病在骨髓微环境下不同的免疫状态，以及这些不同的状态（免疫细胞富集及免疫细胞缺乏）对于病人的生存期，化疗抗性，复发率等多项重要预后指数的影响。通过分析接受化疗以及flotetuzumab双特异抗体免疫疗法的病人中的肿瘤微环境，研究人员证实了对于化疗容易产生抗性的病人，免疫疗法或许是更为有效的干预手段。因此在将来，对于AML这类高风险的血癌，医学界在考虑重点基因变异的情况之外，还应结合病人的肿瘤免疫微环境具体状态，如免疫细胞富集或贫乏的情况，来定制治疗方案，以达到精准医疗的目的。

文献

Vadakekolathuetal.ImmuneLandscapesPredictChemotherapyResistanceandImmunotherapyResponseinAcuteMyeloidLeukemia.ScienceTranslationalMedicine.

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林森

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