一种有效的口服BET抑制剂的设计

一种有效的口服BET抑制剂的设计

研究背景:作者的实验室先前曾报道过一种新型的BET溴结构域抑制剂的设计，该抑制剂含有吡啶并吲哚结构，以RX-37为例（6）。该化合物可以纳摩尔亲和力与BET蛋白结合，并对其他含溴结构域蛋白具有高选择性。它可有效抑制具有MLL1融合蛋白的急性白血病细胞系的细胞生长，因此，6可以进一步优化以达到开发用于治疗人类癌症和其他医学病症的新型有效，有选择性的BET抑制剂的目标。但先前报道的6的合成路线不适合大规模合成，这限制了对其构效关系（SAR）的探索以及对此类化合物的体内评估。因此，作者决定寻找替代性的三环核心结构，进而能够更广泛，更全面地探索SAR。在本研究中，作者发现了化合物31，该化合物以高亲和力与BET蛋白结合，并有效抑制具有MLL1融合蛋白的急性白血病细胞系和一组人类乳腺癌细胞系中的细胞生长。化合物31具有出色的口服药代动力学特性，并且口服可有效抑制小鼠的肿瘤生长。

Result:首先作者通过对BRD4BD2蛋白复合物中6的共晶体结构的分析，发现可以将一个额外的氮原子插入吡啶并吲哚结构中，而不会对化合物与蛋白的相互作用产生不利影响。如7和8所示，作者设计了含有嘧啶并吲哚核心结构的化合物，该化合物相比于合物6的更容易合成(Fig.1)。

作者先合成了化合物7，以确定该设计是有效的BET抑制剂。在竞争性荧光偏振测定中，化合物7分别以Ki=nM和nM与重组人BRD4BD1和BD2蛋白结合。但该化合物仍然缺少与BRD4蛋白中“WPF”疏水口袋相互作用的部分，因此作者将它作为进一步优化的起点(Fig.2)。

因为根据对化合物6及其类似物的SAR数据分析，发现靶向“WPF”疏水性口袋是一种提高BET抑制剂结合亲和力非常有效的方法。作者根据BRD4BD2与化合物7的复合物模型和化合物5（I-BET）与BRD4BD2的复合物共晶体结构的重叠部分设计了化合物8，其中包含化合物5中的疏水基团以靶向“WPF”疏水口袋。化合物8以Ki=12.0nM和10.4nM与BRD4BD1和BD2结合，效力比7强30倍以上，这进一步支持了以WPF结合口袋为靶点确实可以显着改善BET抑制剂亲和力的观点(Fig.2)。相比之下，化合物8与BDR4BD1和BD2蛋白质的结合能力与化合物1和6相同。

在作者之前的研究中发现化合物6中的5元环环可以有效地靶向BET蛋白中的“WPF”口袋。因此，作者接下来进一步探讨使用不同的五元环靶“WPF”口袋所产生的SAR(Fig.3)。在未取代的五元环的化合物9-13中，含呋喃和吡咯的化合物11和12分别具有最高的结合亲和力，并且与BRD4BD1和BD2蛋白质的结合力均比7强5倍。

在与BRD4BD2复合的化合物6的共晶体结构中，环丙基深深插入WPF疏水口袋中，表明五元芳环上的其他疏水取代基可以进一步提高与BRD4蛋白的结合亲和力。实际上，在异恶唑和吡唑基团上具有二甲基取代基的14和15都比未取代的化合物9和10更有效。与BRD4的BD1和BD2蛋白质结合时，化合物14的效力是9的9-10倍，而化合物15的效力是10的3-7倍。尤其是15与BRD4的BD1和BD2蛋白质结合的Ki值是19.7和20.2nM，因此其是相当有效的BRD4抑制剂。

根据化合物15与BRD4BD1和BD2蛋白的良好结合亲和力，作者进一步修饰了化合物15得到化合物16和17。在化合物15的5元吡唑环上具有一个额外甲基取代基的化合物16与BRD4BD1和BD2蛋白的结合亲和力与化合物15相似，但具有与化合物6相同的吡唑基团的化合物17，其与BRD4BD1和BD2结合的Ki分别为7.0nM和2.7nM，表明其比化合物6更有效。

BET抑制剂（如化合物1和6）表现出非常有效的抑制MLL1融合的MV4;11和MOLM-13急性白血病细胞系细胞生长的抑制作用。化合物17抑制MV4;11和MOLM-13细胞系的IC50值分别为6和36nM(Fig.4)。相对而言在这两种急性白血病细胞系中，17对细胞生长的抑制作用比化合物1、5和6更有效，因此化合物17是一种非常有效的BET抑制剂。

作者在三个时间点对化合物17的快速药代动力学进行了评估，以评估其在小鼠中的口服暴露量。化合物17以剂量为25mg/kg口服给药后，在1、3和6h的时间点分别达到±,±和72±46ng/mL的药物浓度，表明在小鼠中有一定的口服暴露。

之后作者将注意力转向对化合物12的修饰。化合物12与BRD4BD1和BD2均具有不错的结合亲和力，Ki值分别为51.9nM和30.6nM，并且以亚微摩尔浓度抑制MV4;11和MOML-13细胞系中细胞的生长(Fig.3.4)。作者根据计算模型发现稠合的双环系统可以有效地靶向WPF口袋，因此作者合成了一系列含有双环系统的化合物，其活性总结在(Fig.5)中。

含有吲哚基的化合物18与BRD4BD1和BD2结合的Ki值分别为4.9nM和1.1nM，是化合物12的10倍。用吡咯并吡啶取代化合物18的吲哚得化合物19，其对BRD4BD1的结合亲和力与18相似，但其结合BDR4BD2的结合力强于18。在吲哚的C4处增加一个氟原子得到20，该原子与BRD4BD1和BD2蛋白具有非常高的亲和力，其Ki分别为0.5nM和2.6nM。在18的吡咯C2处增加一个甲基得到化合物21，其对BRD4BD1和BD2也都具有非常高的结合亲和力（Ki1nM）。化合物20和21的氟取代和甲基取代的结合得到了化合物22，它对BRD4BD1和BD2蛋白都具有高结合亲和力（Ki1nM）。而用氮原子取代21中吲哚基的C6得到化合物23，其效力比21低10倍。化合物23与21结合亲和力的变化与WPF结合口袋的疏水性一致。

受这些含吲哚的化合物高结合亲和力的启发，作者又合成了一系列含有双环非吲哚的化合物。具有2-甲基苯并呋喃的化合物24和含有苯并咪唑的化合物25也以高亲和力结合于BRD4BD1和BD2，但效力不如化合物18。含有吡唑并吡啶的化合物26的效力比18低4倍，而含有1-甲基-1H-吲唑的化合物27的效力比18低10倍。具有1H-苯并三唑的化合物28在1μM时未显示出与BRD4BD1和BD2蛋白具有明显的结合。这些数据表明，该位点的双环形状和电子性质在与BRD4BD1和BD2蛋白质的结合中起着重要作用。

之后作者评估了这些化合物在MV4;11和MOML-13细胞系中抑制细胞生长的能力，结果总结在(Fig.4)中。与它们对BRD4BD1和BD2蛋白的高度亲和力一致，化合物21和22都具有非常强的细胞生长抑制活性。在这两种白血病细胞系中，化合物21在MV4;11和MOLM-13细胞系中的IC50值分别为6.6nM和65nM，而化合物22在这两种白血病细胞系中的IC50值分别为5.1nM和51nM。

基于其与BRD4BD1和BD2蛋白的高结合亲和力和有效的细胞生长抑制活性，作者进一步评估了其在大鼠中的口服生物利用度。药代动力学（PK）数据显示，以25mg/kg的剂量向大鼠口服给药可实现合理的血浆暴露(Fig.6)。

但作者在21中发现的一个缺点是，虽然它在大鼠微粒体中具有良好的稳定性（T1/分钟），但在小鼠和人微粒体中的稳定性却很差，T1/2分别为4分钟和8分钟(Fig.7)。作者通过对人肝微粒体的研究发现，吲哚基的氧化是主要的代谢弱点，因此，作者接下来将修饰重点放在吲哚基上，以提高其代谢稳定性和口服药代动力学。

首先，作者在21的三环核心结构上引入一个甲基，从而生成与BRD4BD1和BD2蛋白具有非常高亲和力的化合物29（Ki1nM）(Fig.8)。与其高结合亲和力相一致，29可有效抑制MV4;11和MOML-13细胞系的细胞生长，IC50值分别为2和20nM(Fig.4)，其效力是21的3倍。化合物29在小鼠和大鼠微粒体中的稳定性极佳（T1/分钟），但在人微粒体中的稳定性较差（T1/2=9分钟）(Fig.7)。

作者发现化合物21的另一个问题是其水溶性差。因此作者合成了一系列含有喹啉环系统的化合物，该系统在双环芳族系统中具有碱性氮，并且与含有较少碱性吲哚芳族基团的化合物21相比应具有更高的溶解度。这些化合物的测试数据汇总在表7中。合成的化合物31（CD）与BRD4BD1和BD2结合的Ki值分别为8.2nM和1.4nM(Fig.8)，并可有效抑制MV4;11和MOLM-13细胞系的细胞生长，IC50值分别为26nM和53nM(Fig.4)。并且31在小鼠，大鼠和人的微粒体中具有出色的稳定性(Fig.7)。这些数据表明，用[6,6]双环喹啉环系统代替[5,6]双环吲哚环系统可以保持对BRD4BD1和BD2的高结合亲和力，同时达到有效的细胞生长抑制活性和优异的微粒体稳定性。

基于这些结果，作者合成了一系列包含喹啉环系统的化合物，其中喹啉环中的氮位于不同的位置。其中化合物34在与BRD4BD1和BD2的结合亲和力以及在MV4;11和MOLM-13细胞系中抑制细胞生长方面的效力略低于31；化合物32与BRD4BD1和BD2蛋白的结合效力比31弱，并且在MV4;11和MOLM-13细胞系中抑制细胞生长的效力比31弱2倍(Fig.4)；而分别在5、6和7位含有氮的化合物35、36和37在与BRD4BD1和BD2蛋白的结合亲和力以及抑制细胞生长方面的效力也均远低于31。因此，在这些包含喹啉基环系统的化合物中，31具有最佳的结合亲和力和细胞效价。

作者又用Fig.6中提供的数据评估了其在大鼠中的药代动力学。在口服25mg/kg时，化合物31的Cmax为ng/mL，比化合物21的Cmax高6倍，口服生物利用度为93％，还发现化合物31的溶解度比化合物21好得多。31易溶于溶剂（5％DMSO+10％Cremophor+85％盐水），21难溶于溶剂。化合物31的口服药物动力学优于化合物21的一个可能的原因是由于31的溶解度高。作者进一步确定了31在小鼠体内的药代动力学(Fig.6)。口服给药25mg/kg时，化合物31的Cmax为.1ng/mL，口服生物利用度为50％(Fig.6)。因此，31在大鼠中具有优异的口服药代动力学，在小鼠中具有中等的口服药代动力学。

为了了解其靶标选择性，作者通过DiscoverX对化合物31与BET家族蛋白（BRD2-4和BRDT）以及其他含溴结构域蛋白的其他亚家族的结合亲和力进行了评估，数据汇总于(Fig.9)。

化合物31对BRD2BD1，BRD2BD2，BRD3BD1，BRD3BD2，BRD4BD1，BRD4BD2，BRDTBD1和BRDTBD2蛋白质的Kd值分别为4.5、0.9、2、0.69、8.4、2、15和5.5nM。它与CREBBP，EP和CECR2结合的Kd值分别为、和nM，而对其他21个含溴结构域的蛋白质的Kd值均nM。因此，31是一种高效的BET抑制剂，与其他含溴结构域的蛋白质相比，具有很高的选择性。

通过DiscoverX进一步评估了化合物31对KINOMEscan平台上种人类激酶的潜在抑制活性。激酶筛选数据显示，仅对PLK4具有适度的抑制活性，IC50值为3.9μM，对所有其他种激酶的IC50值均50μM。

接下来，作者对化合物31在MV4;11异种移植模型中的体内功效进行了测试，并将化合物5用作对照(Fig.10)。功效数据显示5和31都具有相似的强抗肿瘤活性，肿瘤生长抑制率80％，并且两种化合物均未引起小鼠体重减轻或其他毒性迹象(Fig.10)。

除了急性白血病细胞系外，作者还评估了化合物31对19种人类乳腺癌细胞系中细胞生长的抑制活性。Fig.11中提供的结果数据显示，31有效抑制了9种乳腺癌细胞株的生长，ICμM，其他6种细胞株的IC50在1-2μM之间，其余9种细胞株的ICμM。表明虽然化合物31对乳腺癌细胞的抗性不如对带有MLL1融合蛋白的急性白血病MV4;11和MOLM-13细胞系有效，但对IC50为1μM或更低的19种乳腺癌细胞系中，其对近50%的细胞生长具有抑制作用。

为了进一步评估其治疗潜力，作者评估了其在MDA-MB-异种移植模型小鼠中的抗肿瘤活性(Fig.12)。数据显示31在MDA-MB-异种移植模型中非常有效地抑制肿瘤生长。在治疗期间，每天以40mg/kg的剂量给药可基本完全抑制肿瘤生长。在整个实验中，用31处理的小鼠没有体重减轻或其他中毒迹象。

先前的研究表明，BET抑制剂可有效下调肿瘤细胞中的c-Myc和上调p21。因此，作者检查了MV4;11细胞中31对c-Myc和p21水平的影响(Fig.13)。所得数据表明，31在1h时间点以剂量依赖性方式诱导c-Myc快速下调非常有效(Fig.13A)。此外，化合物31以剂量依赖的方式有效诱导细胞周期调节子p21的上调和PARP的切割，而PARP是凋亡的生化标志物(Fig.13B)。作者的Western数据进一步表明，化合物31在细胞中作为有效的BET抑制剂起作用。

为了了解31与BRD4的高结合亲和力的结构基础，作者又成功地确定了与BRD4BD2复合的31的共晶结构(Fig.14)。共晶结构显示出与BRD4BD2的结合方式类似于化合物6所假定的。31的二甲基异恶唑基深入渗透到结合口袋中，并与Asn和两个保守的水分子形成广泛的氢键网络。二甲基异恶唑基团中的一个甲基与Tyr，Val，Leu和Tyr残基形成的疏水口袋结合，另一个甲基与Pro，Phe和Val疏水接触。三环与赖氨酸通道结合。如作者设计所设想的，喹啉基插入“WPF”口袋中，其中氮原子暴露于溶剂中，而稠合的苯基在Trp，Pro，Val，Met和Glu的疏水部分形成的疏水口袋中。31的喹啉基比6的环丙基具有更广泛的相互作用，这与31与BRD4的更高结合力相一致。这种共晶体结构为31与BRD4BD2的高结合亲和力以及进一步的基于结构的优化提供了坚实的结构基础。

总结:在这项研究中，作者设计和合成了一类含9H-嘧啶[4,5-b]吲哚的化合物，目的是获得有效的和口服可利用的BET溴结构域抑制剂。做种发现了化合物31以低纳摩尔亲和力与BET家族蛋白结合，并对非BET含溴结构域的蛋白表现出高选择性，化合物31可有效抑制急性白血病细胞系和乳腺癌细胞系的细胞生长。并且它具有出色的口服生物利用度，代谢稳定。在耐受性良好的剂量表中，它还在小鼠的MV4;11急性白血病和MDA-MB-乳腺癌异种移植模型中显示出强大的抗肿瘤活性。

本文于年5月2日，第一作者是YujunZhao，通讯作者是ShaomengWang，通讯地址是UniversityofMichigan。

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