白血病新突破DPP8DPP9小分子抑制剂

白血病系造血系统的一种恶性疾病，是一种预后较差、病死率较高的恶性肿瘤。因其增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。据报道，我国各地区白血病的死亡率在各种肿瘤中占第8位。白血病是儿童期好发肿瘤，占14岁以下儿童组恶性肿瘤发病的1/3。中国白血病发病率为5.68/10万，死亡率为4.28/10万，男性发病率和死亡率分别为女性的1.29倍和1.34倍。白血病的病因及发病机制至今尚未完全清楚，目前认为是多种环境因素与遗传因素相互作用的结果。

白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。

(一)急性粒细胞性白血病分型

1.FAB分型：

M0：未分化性粒细胞性白血病

M1：部分分化性粒细胞性白血病

M2：分化性粒细胞性白血病

M3：早幼粒细胞性白血病

M4：粒单细胞性白血病

M5：单核细胞性白血病

M6：红白血病

M7：巨核细胞性白血病

急性早幼粒细胞白血病（acutepromyelocyticleukemia，APL）是急性髓系白血病（AML）的一种特殊类型，病情十分凶险。王振义院士带领其团队，采用全反式维甲酸（一般称为维A酸，用于治疗皮肤病痤疮的维A酸乳膏），并联合应用氧化砷（人们常说的砒霜），使得急性早幼粒细胞白血病的五年生存率提升到95%。

2.WHO急性髓系白血病(AML)和相关前驱细胞肿瘤分类

今天本文将重点与大家讨论急性髓系白血病研究。

(二)急性淋巴细胞性白血病分型

ALL根据免疫表型不同可分为B-细胞和T-细胞两大类。WHO将急性淋巴细胞白血病(ALL)分为三种亚型：(1)前体B细胞急性淋巴细胞白血病(细胞遗传学亚型)。(2)前体T细胞急性淋巴细胞白血病(T—ALL)。(3)Burkitt细胞白血病。FAB分型中的急淋形态学亚型分型方法，因可重复性较差，现已基本放弃，不再把急性淋巴细胞白血病分为L1、L2、L3。骨髓中幼稚细胞25％时诊断采用ALL的名称，幼稚细胞≤25％称为母细胞淋巴瘤。

第二种则是慢性白血病：其特征是有功能的已分化成熟细胞过度增生，因此慢性白血应是一种由于信号传导不良或细胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障碍所至。慢性白血病常见有慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。《我不是药神》中格列宁，真名为格列卫，则是用于治疗慢性粒细胞性白血病的靶向药。

年7月，国际著名杂志NatureMedicine刊登了美国斯隆-凯特琳癌症中心通讯作者DanielA.Bachovchin重要发现，该课题组擅长蛋白质组学，化学探针。主要研究方向是丝氨酸水解酶在癌症和免疫系统中的生物功能研究，包括小分子抑制剂的开发和利用。今天，医学方小编就来详细和大家分享一下这篇好文章。

之前研究报道,丝氨酸二肽酶DPP8/9小分子抑制剂在小鼠和人单核细胞和巨噬细胞中诱导细胞焦亡。细胞焦亡（pyroptosis）是一种细胞程序性死亡方式，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体重要天然免疫反应，在抗感染和内源危险信号中发挥重要作用。相比于细胞凋亡，细胞焦亡发生更快，并伴随大量促炎症因子的释放。

在小鼠骨髓细胞中，Dpp8/9抑制激活炎性体传感器Nlrp1b，Nlrp1b又激活前caspase-1以介导细胞死亡，但Dpp8/9抑制诱导人骨髓细胞焦亡机制尚不清楚。这篇文章证明了含CARD的蛋白CARD8介导DPP8/9小分子抑制剂可以诱导的人骨髓系细胞的caspase-1依赖性焦亡。文章进一步表明，DPP8/9抑制剂在大多数人急性髓系白血病(AML)细胞系和原代AML样品中诱导细胞焦亡，但在许多其它谱系细胞中没有这个现象，并且在人AML的CDX移植瘤小鼠模型中抑制肿瘤发展，表明DPP8/9小分子抑制剂激活是一种具有很大潜力治疗AML新方法。

1、DPP8/9小分子抑制剂Val-boroPro有效抑制多种AML细胞增殖

图1

在之前的报道中，Val-boroPro是一个前脯氨酸剪切的丝氨酸蛋白酶非选择性小分子抑制剂（图1.a），可以诱导小鼠肿瘤模型抗癌免疫反应，诱导产生多种细胞因子。Val-boroPro能够抑制丝氨酸二肽酶DPP8/DPP9，进而激活pro-caspase-1，引发细胞焦亡。同样，与小鼠表型类似，Val-boroPro能激活人免疫系统，引起人急性髓性白血病THP-1单核细胞发生焦亡，但在人体中Val-boroPro激活pro-caspase-1具体分子机制，以及能否应用于免疫治疗并不清楚。为了验证AML细胞对Val-boroPro的敏感性，首先作者们在不同的急性髓性白血病AML癌细胞系中用CellTiter-Glo检测，发现大多数AML细胞系都对该抑制剂敏感，IC50在6-nM之间，对于不敏感的AML细胞系也在加入Val-boroPro五日后产生很好的抑制效果（图1.b-f）。因为Val-boroPro对其他丝氨酸水解酶也有抑制作用，为了检测DPP8/9是否是Val-boroPro的靶点，研究人员还检测了DPP7或DPP4的抑制剂但并不能引起类似的表型，作为阳性对照，DPP8/9敲除的THP-1细胞中则能够引起自发的细胞焦亡。因此，Val-boroPro的确通过抑制DPP8/9发挥作用。

2、AML细胞对Val-boroPro敏感性主要是Caspase-1

图2

虽然绝大部分急性髓性白血病细胞都对Val-boroPro敏感，但不同的细胞系敏感差异很大。因此，作者们想研究Val-boroPro抑制过程如何引起细胞焦亡，找到对细胞敏感的因素，首先作者研究了这些细胞中基因的表达谱。从CCLE数据库中来源的RNAmicroarray发现，敏感型细胞中caspase-1的水平明显上升，而DPP8/9没有明显变化（图2.a）。处理Val-boroPro也会引起焦亡底物gasderminD(GSDMD)产生，而不是凋亡底物poly-ADP-ribosepolymerase(PARP)的剪切体，说明Val-boroPro引起的是细胞焦亡表型，而不是其它死亡方式（图2.c）。同时，基因敲除实验也确认了caspase-1对Val-boroPro细胞增殖抑制的敏感性是必须的（图2.d，e）。

3、CARD8介导DPP8/9抑制剂诱导人类骨髓瘤细胞焦亡

图3

然后，研究人员尝试寻找是什么激活细胞中pro-caspase-1。结合前人研究Val-boroPro在小鼠中的结果，作者们对准了hNLRP1这个同源蛋白质（图3.a），但实验证明该蛋白质并不是必需的，而在人细胞中另外一个结构类似的蛋白质CARD8却能产生类似的表型，在THP-1,MV4;11和OCI-AML2细胞中基因敲除CARD8发现对Val-boroPro耐药，并且没有产生GSDMD剪切焦亡底物(图3.b–d)，说明CARD8和caspase-1介导DPP8/9抑制剂诱导人类骨髓瘤细胞焦亡。在HEKT细胞中瞬转CARD8或NLRP1发现可以稳定表达caspase-1，和焦亡底物GSDMD。Val-boroPro处理后，发现仅仅是表达CARD8的细胞对药物敏感(图3.e,f).NLRP1和CARD8的FLIND区域可以自水解，但是需要Val-boroPro激活，如果把这个区域利用SA突变，就对Val-boroPro就不敏感了(图3.e,f)。用抑制剂激活NLRP1B，蛋白酶抑制也会阻碍CARD8的激活(图3.g)。有趣的是，Val-boroPro处理后CARD8的N端出现明显下降，甚至消失，C端却没有任何变化(图3.b,c,d,f)。过表达C端而不是N端在表达caspase-1的HEKT中有毒性(图3.h)·。研究人员推测DPP8/9抑制剂可以诱导CARD8N端的蛋白酶降解，释放C端激活细胞焦亡，但是具体机制仍需要探究。总之，CARD8和caspase-1介导DPP8/9抑制剂诱导人类骨髓瘤细胞焦亡

4、DPP8/9抑制剂Val-boroPro抑制人AML的小鼠模型中肿瘤发展

图4

小鼠体内实验中，发现Val-boroPro可以有效抑制小鼠的CDX移植瘤肿瘤，并且存活率都明显改善，外周血表达的炎症因子也有大幅度降低(图4.a-f)，同样在病人样本PDX模型中也得到证实，实体瘤肿瘤明显降低(图4.g)。

这篇文章发现DPP8/9的抑制剂Val-boroPro能够有效诱导人急性髓行白血病AML细胞发生焦亡，并且详细阐明该过程是由CARD8作为炎症体的感受器，介导激活caspase-1而发挥抑癌作用，并在多个细胞和动物模型上得到验证。这项研究非常有希望应用于急性髓行白血病AML临床治疗。整篇研究以细胞焦亡这个表型为起点，蛛丝剥茧详细严谨阐明药物作用机制，对我们科研工作者们很具有很强的借鉴意义。

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