靶向CDK6的PROTAC选择性抑制费城

研究背景

费城阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ALL）是由BCRABL1亚型p驱动的预后不良的恶性肿瘤。第22号染色体长臂和第9号染色体交互易位所产生Bcl-Abl融合基因。Bcl-Abl融合基因的过度表达活化一系列下游的信号通路，导致白血病的产生。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）是治疗Ph+ALL的主要手段。与标准化疗相结合，TKIs显著改善了Ph+ALL患者的预后。然而，由于对TKIs的耐药性，导致患者白血病的复发。

在之前的研究中，作者已经报道Ph+ALL细胞依赖CDK6表达，而CDK4并不是必要的。同时，由于CDK6与增强或抑制基因表达的转录调节剂的相互作用，CDK6在血液系统恶性肿瘤中具有促进生长的功能。PROTAC是包含目标蛋白配体以及通过连接链连接的E3连接酶的配体的分子，可以募集E3连接酶以实现泛素化和蛋白酶体降解。与传统竞争性抑制剂相比，降解CDK6的PROTAC可以防止临床上使用的CDK4/6酶抑制剂引起的CDK6代偿性的上调。作者报告了靶向CDK4/6的PROTAC的研究，该PROTAC可以迅速并优先降解CDK6，抑制Ph+ALL细胞的增殖。

实验结果

作者发现，在Ph+BV细胞中，CDK6沉默显著诱导了凋亡。为了评估CDK6沉默诱导的凋亡是否是特异性的，作者将shCDK6-88克隆到四环素调节的载体中，并转导到BV细胞中。shRNA抗性形式的CDK6的表达促进了CDK6诱导的shCDK6-BV细胞的凋亡，相对优于用帕博西尼处理。向NSG小鼠注射多柔比星诱导的shCDK6-BV细胞，以比较CDK6沉默与CDK6酶促作用的效果。结果显示，对照小鼠全部死亡。在经多柔比星处理的小鼠中几乎检测不到CD白血病细胞。在体内抑制Ph+ALL方面，CDK6沉默比CDK4/6抑制显着更有效。因此，选择性CDK6沉默相对于非选择性CDK46抑制剂（例如帕博西尼）具有明显的优势。

Figure1:在抑制Ph+ALL的免疫缺陷小鼠方面，CDK6沉默比CDK4/6酶促抑制更有效。

与用帕博西尼治疗的小鼠相比，DOX治疗的小鼠的存活期更长，这表明激酶依赖性效应相比CDK6沉默诱导的白血病的治疗作用更为明显。在通过CDK6沉默选择性下调的基因中，JAK1和NFATC2可能影响生存信号通路，而较低水平的SMARCD2和HDAC1可能影响染色质重塑，可能影响生存基因的转录。作者还观察到CDK6和HDAC1表达之间显着正相关，CDK6和SMARCD2表达之间显着正相关，CDK6和SLC2A3/GLUT3之间显着负相关。

Figure2：CDK6沉默诱导的生长抑制与特定的基因表达相关

作者以帕博西尼的晶体结构结设计合成了靶向CDK4/6的PROTAC。利用不同连接链合成帕博西尼衍生物。包括具有不同连接链的VHL和CRBN配体的PROTAC。结果显示，招募CRBN的PROTACYX-2-是体外CDK4和CDK6的最有效的降解剂。

Figure3:开发选择性降解CDK6，靶向CDK4/6的PROTAC

YX-2-处理可抑制细胞进入S期，抑制RB（抑癌基因）磷酸化和FOXM1（在人类多种恶性肿瘤细胞中发现其过表达）表达，并诱导BV和SUP-B15细胞中CDK6的选择性降解；YX-2-治疗的正常CD祖细胞中也观察到CDK6表达降低，但CDK4表达未降低。同时作者发现，治疗正常细胞不会产生像治疗BV细胞一样产生对S期的抑制或降低磷酸化RB。相比之下，用CDK4/6抑制剂帕博西尼处理对BV和正常CD细胞具有相似的生长抑制作用，

Figure4:PROTACYX-2-在Ph+ALL细胞系和正常造血祖细胞中的作用

作者评估了YX-2-在小鼠肝微粒体内的代谢稳定性，并将其与帕博西尼和4羟基-沙利度胺（AC-1-）进行比较。结果发现，YX-2-具有良好的代谢稳定性，半衰期为35分钟。对照化合物咪达唑仑的稳定性差。小鼠药代动力学研究显示，血浆水平显示最大浓度为nM，并在4小时后从血浆中清除。帕博西尼和YX-2-在抑制S期细胞百分比和降低磷酸化RB以及减少FOXM1表达方面无明显差异。用PROTACYX-2-处理可降低CDK6，并降低CDK4水平。相反，帕博西尼会促进CDK6表达。

Figure5:PROTACYX-2-在小鼠中可生物利用，并且在抑制Ph+ALL增殖方面具有一定的药理活性

人源肿瘤细胞系异种移植（cellderivedxenograft,CDX），即将体外传代培养的肿瘤细胞接种至免疫缺陷小鼠，首先，作者评估了用YX-2-进行的体内治疗对正常的造血细胞是否有毒性。结果显示，在治疗期间，小鼠没有表现出体重减轻的迹象。骨髓细胞的流式结果发现，干细胞和祖细胞以及B细胞前体的百分比没有显着变化。同样，除了血小板和网状细胞的适度增加外，外周血细胞亚群的计数也正常。作者比较了帕博西尼和YX-2-对NSG小鼠注射了原发性Ph+ALL细胞并连续治疗10次后外周血白血病负荷的影响。结果显示，YX-2-的治疗在缓解外周血白血病负担方面与帕博西尼效果相似。

Figure6:PROTACYX-2-在人源肿瘤细胞系异种移植的Ph1ALL中的作用

总结与展望

费城阳性（Ph+）急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞生长需要调控基因CDK6的表达，而CDK4蛋白的表达却不是必需的。此外，CDK6沉默比用CDK4/6抑制剂帕博西尼抑制小鼠的Ph1ALL更有效。作者开发了靶向CDK4/6的靶向蛋白水解的嵌合体（PROTAC），该嵌合体在体外抑制CDK6的酶促活性，在Ph1ALL细胞中比CDK4促进CDK6的快速优先降解，并显著抑制细胞的S期。尽管CDK6被有效降解，但在CD正常造血祖细胞中未观察到CDK6的降解。用降解CDK6的PROTACYX-2-处理可显著减轻酪氨酸激酶抑制剂耐药的原代Ph+ALL细胞的小鼠的负担。这些研究提供了“原理验证”，通过抑制酶活性并促进其降解CDK6的靶向PROTAC做为一种有效的策略，可治疗Ph+ALL以及其他依赖CDK6的血液系统恶性肿瘤的。此外，作者建议用该PROTAC治疗Ph+ALL应当避免与高浓度的正常造血祖细胞作用，以防止通过双重CDK4/6抑制剂治疗引起的中性粒细胞减少。

本文于年4月30日发表在BLOOD上，第一作者是MarcoDeDominici,PatriziaPorazzi,通信作者是BrunoCalabretta,JosephM.Salvino.托马斯杰斐逊大学和威斯达研究所为通讯单位。